בניסויים PCR (תגובת שרשרת פולימראז), אריזה עשויה להיראות פשוטה, אך היא משפיעה ישירות על יציבות המגיב, קלות השימוש ותוצאות אמינות. בין אם אחסון והובלת מעבדה - ריאגנטים מוכנים או תערובות מסחריות, שליטה בטכניקות אריזה PCR נכונות יכולה להימנע משגיאות נפוצות ולשפר את היעילות הניסיונית. להלן, אנו חולקים טיפים מעשיים בנושא בחירת חומרים, אסטרטגיות אריזה ופרטי אחסון.
I. בחירת חומרי אריזה: עדיפות לתאימות ומגן
תגובות PCR רגישות לטמפרטורה, אור ומזהמים, ולכן חומרי האריזה חייבים לעמוד בשלוש דרישות מפתח: אטימות אוויר, אור - הגהה ואינרטיות כימית.
עבור צינורות צנטריפוגה וצלחות PCR, עדיף פוליפרופילן (PP), בשל השקיפות הגבוהה שלו ו- DNase/RNase - תכונות בחינם . 0.2 ml דק - צינורות קירות הם אידיאליים להעברת חום מהירה, ואילו 0.5 צינורות של 0.5 מ"ל הובלו עבור חיקוי. עבור 96 - צלחות PCR היטב, אנו ממליצים לבחור עיצוב חצאית (להקל על מניפולציה רובוטית) או לעיצוב שאינו מחולק (לשימור חלל).
שיטת איטום: צינורות צנטריפוגה קונבנציונליים משתמשים בכובעים שטוחים או מורמים (כדי למנוע אידוי והתייבשות). עם זאת, במשך - אחסון מונחים, חום - סרט איטום (כגון parafilm) או סרט נושם (כגון Aeraseal) מומלץ לאזן לחץ פנימי וחיצוני. צלחות PCR מומלצות להשתמש באוטמי נייר אלומיניום דבק (גבוה - עמיד בפני טמפרטורה) או בעצמי - סרט דבק (לסינגל - שימוש).
הגנה על אור: יש לעטוף ריאגנטים המכילים אור - רכיבים רגישים (כגון צבעים או פריימרים מסוימים) בסכל אלומיניום, או לוחות PCR שחורים (זמינים מיצרנים מסוימים).
II. טכניקות חלקה: צמצום הפסדים מהקפאה חוזרת - מחזורי הפשרה
ריאגנטים של חלל הוא צעד ליבה באריזת PCR ומשפיע ישירות על ההתרבות הניסיונית.
Master Mix Aliquoting: תערובות אב מסחריות (כגון אנזים Taq ו- DNTP Mix) מומלצים להיות מלאים על בסיס נפח התגובה בתוספת 5% {}}} 10% מרווח (למשל, לתגובה של 20 μl, Aliquot 22 μl לכל צינור). הימנע משימוש ישירות מאריזות בתפזורת, שכן מחזורי הפשרה קפואים חוזרים ונשנים - יכולים להוביל לירידה בפעילות האנזים (אנזים TAQ יכול לאבד כ -5% פעילות לכל מחזור הקפאה).
פריימרים ותבניות: פריימרים (במיוחד פריימרים מותאמים אישית) מומלצים להיות מחויבים מ 100 מיקרומטר פתרונות מלאי ולאחסן ב - 20 מעלות. מדוללים לריכוז עבודה (בדרך כלל 0.1–1 מיקרומטר) לפני השימוש. יש לנקוט בתבניות כמו DNA גנומי בכמויות יחיד {}}} כדי למנוע זיהום צולב.
טיפים למניעת זיהום: וודא כי צינורות הצנטריפוגה יבשים לפני חלקה (אתנול שיורי יכול לעכב PCR), לפני - קצות פיפטה מגניבים למניעת ריאגנטים לקור לדבוק בקיר, וללבוש כפפות לאורך כל התהליך כדי להימנע מזיהום DNA בעור.
III. תיוג וניהול רשומות: הימנע ממלכודת "הקופסה השחורה"
תיוג ברור הוא קריטי לאריזות PCR; תיוג שגוי יכול להרוס את כל הניסוי.
מידע על תיוג חובה: שם מגיב (למשל, "2 × TAQ MasterMix"), ריכוז/תוכן (למשל, "10 מ"מ DNTPs"), מספר אצווה (לצורך עקיבות), תנאי אחסון (למשל, "-20 מעלות מוגנים מפני אור"), תאריך חלקה ותאריך תפוגה (למשל, "שימוש 6 חודשים").
תיוג מיוחד: אם המגיב מכיל גליצרול (נוזל לרדיאטור), צבעים (למשל, SYBR ירוק) או תוספים (למשל, BSA), יש לספק מידע נוסף (למשל, "מכיל 50% גליצרול, אל תאחסן בטמפרטורות גבוהות").
סנכרון רשומות: מומלץ להשתמש בגיליון אלקטרוני או תוכנת ניהול מעבדה (למשל, Labguru) כדי לרשום את הפרמטרים המפורטים של תוכן כל הצינור (למשל, רצף פריימר, ערך TM) ולשייך אותם למספר התווית הפיזית.
Iv. אחסון ותחבורה: איזון בין טמפרטורה והגנה גופנית
היציבות של ריאגנטים PCR תלויה מאוד בתנאי האחסון, ונדרשת הגנה נוספת במהלך ההובלה.
אחסון כללי:
אנזימים (Taq, Transcriptase הפוך): Long - אחסון מונחים ב - 20 מעלות (הימנע מחזורי הפשרה הקפאה חוזרים ונשנים; חלוקת ואחסון של -80 מעלות לשימוש עתידי);
פריימרים/בדיקות: אחסן ב -20 מעלות למשך למעלה משנה (אם מכיל קבוצה שונה כמו ביוטין, הגן מפני אור);
Non - מאגרי אנזים (למשל, PBS): קצר - אחסון מונחים ב -4 מעלות (עד חודש).
דרישות תחבורה:
לצורך הובלת שרשרת קרה, השתמש בקרח יבש (- 78 מעלות) לאנזימים (מתוחזקים מתחת ל -20 מעלות), ובקרח כחול (בסביבות 0 מעלות) עבור מאגרים לתחבורה לטווח קצר.
הימנע מרטט מוגזם (יש לאבטח צלחות PCR בתיבות קצף כדי למנוע ערבוב של ריאגנטים בין בארות).
במהלך טמפרטורות קיץ גבוהות, הוסיפו שכבת בידוד לאריזה (למשל, תיק בידוד נייר אלומיניום + חבילת ג'ל קפואה).
V. בעיות ופתרונות נפוצים
בעיה 1: משקעים מגיבים (למשל, משקעים של DNTP או MGCL₂ בטמפרטורות נמוכות) → תמיסה: בקצרה צנטריפוגה (1000 סל"ד, דקה אחת) לפני הקמת. ממיסים בחממה של 37 מעלות לפני השימוש ומערבולת כדי לערבב היטב.
בעיה 2: אוטם צלחת מתקלף בקלות → פתרון: בחר חום - אוטם עמיד עם גיבוי דבק, או השתמש בחותם חום (מתאים לניסוי תפוקה גבוה {}}).
בעיה 3: תוויות מטושטשות → פתרון: השתמש בסמן אטום למים (כגון Sharpie) או בלייזר - תוויות להדפיס כדי למנוע מחיקת כתב יד על ידי אלכוהול.
מַסְקָנָה
אריזת PCR היא יותר מסתם ריאגנטים "אריזה"; זו קו ההגנה הראשון לאמינות ניסיונית. על ידי בחירת חומרים מתאימים, סטנדרטיזציה של תהליך ה- Aliquoting, שמירה על תיוג יסודי ושמירה על בקרת טמפרטורה קפדנית במהלך ההובלה, אתה יכול להפחית משמעותית את הטעות האנושית, ולהבטיח תגובות הגברה יציבות יותר ויציבות ותוצאות אמינות יותר. זכור: פרטים קובעים את ההצלחה. תרגילי אריזת PCR נכונים יכולים לחסוך פתרון תקלות משמעותי בזמן לאורך כל הניסוי שלך!